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目标区域捕获测序（Target Region Sequencing）是一种高通量测序技术，它专注于对基因组中特定感兴趣的区域进行深入研究。这种技术通过定制与目标区域互补的探针，与基因组DNA进行杂交，从而富集这些区域，并随后进行高通量测序。
一、原理
目标区域捕获测序是通过设计特定的探针，这些探针与目标基因组区域部分或全部互补，从而捕获并富集这些区域。随后，对富集的DNA片段进行高通量测序，以获取该区域的详细序列信息。二、技术优势高密度信息：能够针对目的基因组区域进行高精度的遗传变异位点检测。
高效性：适用于疾病的大样本量分析，包括多种遗传性疾病和癌症的研究。
临床应用广泛：适用于单基因遗传病检测、癌症易感基因检测、心脑血管疾病基因检测、用药指导基因检测等。
三、常用技术分类
目前，常用的目标区域捕获测序技术主要分为以下几类：
杂交捕获（Hybrid Capture）
原理：通过人为设计探针与目标区段部分或全部互补，将目标区段捕获。未设计探针区段的片段则会被洗脱丢弃，之后通过变性将探针和被捕获的片段分开进行二代测序文库构建。
分类：包括固态杂交和液态杂交。固态杂交在芯片上布满探针，通过探针将目标区段捕获；液态杂交则将探针放在液相中，通过磁珠等方式进行捕获。
优点：捕获区段大，均一性好。
缺点：特异性较差，容易捕获非目标区段。
分子倒置探针（Molecular Inversion Probes, MIP）
原理：设计一个口袋状探针，探针分为三部分：通用序列以及探针的5'端和3'端。探针的5'端和3'端与目标区段退火结合后，通过DNA聚合酶和连接酶补平缺口成完整的环状探针。再利用外切酶将剩余未捕获探针和DNA序列消化，最终保留完整环状产物进行测序。
优点：特异性好，捕获完成后的片段能够直接进行建库。
缺点：捕获效率不高，有些区段难以设计探针进行捕获。
多重PCR
原理：利用多重PCR反应，同时扩增多个目标区域序列，然后通过PCR反应或酶连接反应将二代测序所需的接头序列引入到扩增子产物的两侧，得到扩增子文库进行测序。
优点：灵敏度高，检测速度快。
缺点：检测区域小，可能产生非特异性扩增和二聚体，且扩增的GC偏好导致覆盖均一度差。
四、应用领域
目标区域捕获测序技术已广泛应用于疾病研究和临床诊断中，特别是在遗传性疾病、癌症、心脑血管疾病等领域发挥着重要作用。通过该技术，可以更加精确地识别和验证与疾病相关的候选基因或位点，为疾病的预防、诊断和治疗提供有力支持。
基于 ONT 平台的目标区域捕获
在一些测序应用中，研究的重点不是全基因组，而是单个基因，或基因组区域的某一小部分。在这些情况下，通过全基因组测序进行特征分析可能是低效的和昂贵的。通过目标区域捕获测序不仅可以减少非目标测序区域的成本，实现目标区域高深度的数据富集。同时还减少了数据分析的负担，并实现了一个更快的工作流。
利用长读长技术进行的靶向测序可以实现对目标区域SNV和SV甚至甲基化的一次性测序，可以通过以下几种方式来实现：
扩增子测序；基于探针捕获的富集；基于cas9的富集；自适应采样（Adaptive sampling）。
自适应采样（Adaptive sampling）提供了一种快速和灵活的方法，通过耗尽脱靶区域来丰富感兴趣的区域：目标选择发生在测序本身过程中，不需要前期样本操作。由于纳米孔测序的实时特性，在测试模式中选择“自适应采样”就可以在测序开始确定正在测序的链是否在感兴趣的区域（ROI）内。如果读取没有映射到ROI，MinKNOW将逆转应用电位的极性，将链从孔中排出，这样它就能够接受一个新的、不同的模板链。脱靶链不断被拒绝，直到ROI的链被检测到并允许继续测序。
在自适应采样（Adaptive sampling）中，当目标基因组的比例为<10%时，无论目标的数量或目标的大小，都可以获得ROI的5-10倍富集，这相当于人类基因组测试中靶点的~20-40倍测序深度。
与参考基因组比对率、测序深度、覆盖度分析
样本比对率，指比对到参考基因组上的数据量除以有效测序数据量，反映样本测序数据与参考基因组的相似性。测序深度，指比对到参考基因组的碱基总数除以基因组大小；覆盖度，指被测到的该物种基因组碱基总数占该物种基因组长度的百分比；测序深度和覆盖度能够直接反应测序数据的均一性及与参考序列的同源性。
基因功能富集分析
对注释、筛选得到的候选基因进行GO，Pathway，miRNA，Disease，Proteome，Phenotype等功能富集。富集分析中采用P-value的多重检验 校正值Q-value来控制FDR（False Discovery Rate），此外，也可以采取更严格的Bonferroni多重校正法（Bonferroni multiple correction method）。 缺省富集显著性阈值为控制FDR的Q-value<0.05。
候选基因集蛋白互作网络分析
对候选基因集进行蛋白互作网络分析，寻找相互作用的共调控基因。和代谢通路类似的，不同患者的突变基因可能不同，但是存在相互作用的基因突 变导致的表型可能是一致的。寻找存在相互作用的突变基因，能够帮助定位真正和疾病相关的致病基因。
克隆结构分析
肿瘤异质性主要是肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出基因方面的改变，从而使肿瘤细胞的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感 性、预后等各方面产生差异。对肿瘤组织进行克隆结构分析正是基于肿瘤异质性，通过信息分析手段，将肿瘤组织内遗传突变信息相似的肿瘤细胞进行聚类。
英文标题：
Early Reduction in ctDNA Predicts Survival in Patients with Lung and Bladder Cancer Treated with Durvalumab
中文标题：
ctDNA早期减少可预测durvalumab治疗的肺癌和膀胱癌患者生存情况
研究背景：
免疫治疗已经改变了许多实体肿瘤的治疗方法，一些患者获得了长期的利益，但如何识别这些患者仍不清楚。从血浆中提取的循环肿瘤DNA（ctDNA）中检测到的体细胞突变可以作为疾病进展、治疗反应以及原发性和转移性病变的克隆性的指标。因此，ctDNA分析可以为肿瘤负荷的纵向监测提供一种有价值的无创和肿瘤特异性标记物。
主要发现：
作者对8例非小细胞肺癌（NSCLC）患者的治疗前及治疗后第6周的ctDNA，72例EGFR-野生型NSCLC患者及9例泌尿道上皮癌（UC）患者的ctDNA进行目标区域测序（Guardant36073基因panel）。在96%的患者中检测到体细胞变异。VAF的变化先于影像学反应，6周时VAF减少的患者肿瘤体积明显减少，无进展时间和总生存期更长。NSCLC和UC的ctDNA VAF变化与治疗时间、抗肿瘤活性和临床结果密切相关。早期治疗中ctDNA VAF的减少可能是免疫治疗长期获益的一个有用的预测因子。前瞻性研究应该验证这些发现，以及通过识别对检查点抑制剂单药治疗无反应者和指导联合治疗，验证利用ctDNA的早期变化进行治疗决策的价值。 本研究探索了ctDNA用于预测抗PD-L1药物durvalumab存活率的可行性。揭示了可利用ctDNA早期变化识别免疫检查点抑制剂单一疗法并指导组合治疗来作出治疗决策。
参考文献：Rajiv Raja, Michael Kuziora, et al. Early reduction in ctDNA predicts survival in lung and bladder cancer patient streated with durvalumab[J]. Clinical Cancer Research, 2018.
下载网址：
https://aacrjournals.org/clincancerres/article/24/24/6212/15392/Early-Reduction-in-ctDNA-Predicts-Survival-in?searchresult=1
英文标题：
Developing a liquid capture chip to accelerate the genetic progress of cattle
中文标题：
肉牛基因组选择育种液体捕获芯片“Cattle110K”
研究背景：
低成本、大规模的基因分型技术对家畜的分子育种研究至关重要。近年来，肉牛高密度SNP芯片（Illumina BovineHD Bead Chip）和中密度SNP芯片（Illumina Bovine SNP50 Bead Chip）被广泛应用于全基因组关联分析（GWAS）、基因组选择（GS）等研究中。然而，传统的磁珠芯片仅能检测已知的SNP而无法发现新的变异位点。二代测序可以检测到整个基因组中的所有变异，但对于分子育种领域的大规模基因分型来说，价格仍然过于昂贵。靶向捕获测序技术（GBTS）为这一问题提供了解决方案，该技术将芯片和二代测序的优点结合起来，具有低成本、高准确度和设计灵活等特点。
主要发现：
本研究基于GBTS技术，开发了一款针对肉牛的液相捕获芯片Cattle110K，评估了在实际样本中的分型表现以及在GWAS研究中的应用效果，同时对这款芯片和肉牛高密度芯片的遗传评估准确性进行了对比。在Cattle110K芯片面板设计阶段，创新团队在肉牛主要经济性状候选基因鉴定挖掘和全基因组选择技术应用研究的基础上，从GWAS，BayesB，eQTL-mapping，ATAC-seq等方法筛选的候选功能变异中，挑选出该芯片的目标单核苷酸多态性位点，经过参考基因组版本转换、位点评估和样本测试，最终保留112180个基因检测位点，相邻SNP标记平均间距为22.15Kb，测试样本中最小等位基因频率均值为0.32，重复样本基因型一致率为99.21%，与Illumina肉牛高密度芯片之间的一致率平均为98.17%。为验证Cattle110K实际应用效果，创新团队对国内外主要肉牛品种进行了测试，并在华西牛群体中开展全基因组关联分析以及体尺和屠宰性状的全基因遗传评估准确性的研究。其中，在肉牛重要经济性状（宰前活重、胴体长、十字部高和大理石花纹评分）的GWAS分析结果中，鉴定到6号染色体与宰前活重显著相关的基因组区域（NCAPG-LCORL），在13号染色体和8号染色体上分别找到与十字部高和大理石花纹评分相关的新的候选基因组区域。在全基因组选择应用方面，Cattle110K在基因组预测方面具有与BovineHD相当的性能，在宰前活重、屠宰率等上性状，该芯片基因组估计育种值的（GEBV）准确性还有所提高。研究结果表明，Cattle110K芯片包含肉牛重要经济性状相关位点，位点分布均匀，分型准确性高，性价比好。采用该芯片对实际样本进行基因分型发现，在GWAS和GS的分析中都具有较高的可靠性和准确性。Cattle110K为肉牛育种提供了一个高效、经济的基因分型工具，将有助于加快肉牛遗传改良的进程，有力支撑肉牛基因组选择技术的推广应用。
参考文献：Chen,
下载网址：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/aro2.58