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Direct RNA测序技术利用Nanopore测序平台的纳米孔传感技术，当RNA分子通过纳米孔时，其电流信号会发生变化，这些变化被记录下来并转化为数字信号，进而解析出RNA的序列信息。该技术不经反转录和扩增，能够直接读取全长转录本，且保留了RNA分子的原始修饰信息，如m6A、m5C等甲基化修饰和假尿苷修饰，是第一次实现真正意义上的转录组水平的RNA直接测序。

Poly(A)尾是真核生物mRNA分子3'端的一段多聚腺苷酸序列，对mRNA的稳定性、翻译效率以及细胞内定位等方面具有重要影响。研究Poly(A)尾的长度、变异及其调控机制，对于理解基因表达调控、疾病发生发展等具有重要意义。Direct RNA测序技术能够直接读取RNA分子的全长序列，包括其3'端的Poly(A)尾。这使得研究者能够准确估算Poly(A)尾的长度，而无需依赖传统的间接方法（如通过酶切或PCR扩增），这将有助于揭示基因表达调控的复杂性和多样性，为揭示基因表达调控的复杂机制提供了新的工具和方法。

选择性剪接可以让每个基因产生大量的mRNA异构体，这又能反过来改变蛋白质的组成和功能。传统RNA测序技术产生的短读长丢失了位置信息，使得正确组装选择性剪切mRNA异构体存在挑战性。三代转录组测序（通常指单分子测序技术，如PacBio、Oxford Nanopore Technologies等平台）由于其技术的长读长和单分子特性，能够一次性读取真核生物的全长转录本信息，无需进行片段打断和拼接，从而避免了组装错误和潜在的信息丢失。这对于挖掘新转录本以及isoform（转录本亚型）的研究具有重要意义。它能够准确反映每个基因的转录本异质性，包括可变剪接、融合基因、polyA尾乃至甲基化的变化等。

mRNA，‌在细胞内总RNA中所占的比例较低，‌仅为2%~5%。Direct RNA测序首先基于mRNA的poly A尾结构利用带有OligodT序列的引物将mRNA反转为RNA和cDNA的杂合链，并完成扩增同时添加条形码标记（barcode）。最后，将快速测序接头连接到PCR产物上，完成测序文库的构建并进行上机测序。