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真核生物的基因组 DNA 以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与 DNA 在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing，简称ChIP-seq）技术是一种研究蛋白和DNA结合的有利工具。实验原理是将染色质免疫共沉淀和高通量测序相结合，通过目的蛋白的特异性抗体，将带有特定修饰的目的蛋白-DNA复合物沉淀下来，从而获取该目的蛋白结合的DNA。再通过DNA高通量测序，获得该蛋白在染色体上的分布情况。利用该技术不仅可以检测转录因子在全基因组上的结合位点，还可以研究各种组蛋白修饰在全基因组上的分布情况。是研究蛋白和DNA体内结合的经典技术。染色质免疫共沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation assay,ChIP）是目前唯一研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的方法。


实验流程：

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样品要求：

1.细胞数量大于2e6；

2.新鲜或者冻存组织，植物组织大于1g，动物组织大于500mg；

3.提供抗体和WB验证结果。

Peaks 在 TSS 附近的分布



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Peaks 在染色体上的分布



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Peaks 在基因组功能区的分布


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Peak 相关基因的富集分析



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富集区间 Motif 分析

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文献解读：High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer

研究背景与目的：肿瘤异质性是癌症治疗与耐药性产生的重要基础。尽管基因突变和转录组异质性已被广泛研究，但染色质状态在单细胞水平的异质性及其在肿瘤进化中的作用尚不清楚。传统的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）是群体（bulk）水平的方法，会掩盖细胞间的差异。而单细胞ATAC-seq等技术无法全面捕捉人类基因组中丰富的染色质状态多样性，例如无法有效检测与稳定转录抑制相关的H3K27me3等抑制性标记。因此，本研究旨在开发一种高通量单细胞ChIP-seq（scChIP-seq）技术，以在单细胞分辨率下解析乳腺癌中染色质景观的异质性，并探究其在获得性耐药中的作用。

主要方法与发现：

  1. 高通量scChIP-seq技术平台的建立：研究者开发了一种基于液滴微流控的高通量scChIP-seq工作流程，能够对数千个细胞进行染色质状态分析，每个细胞平均可检测多达10,000个位点。该方法首先将单个细胞与微球菌核酸酶在液滴中裂解并消化染色质，然后与携带独特条形码的水凝胶珠液滴进行一对一融合，在液滴内完成核小体条形码标记，最后进行免疫沉淀和测序文库构建。使用人B细胞（Ramos）和T细胞（Jurkat）的验证实验表明，该方法能准确地从单细胞H3K4me3和H3K27me3图谱中重建细胞身份，分类特异性超过99.5%，且累积的单细胞谱与bulk ChIP-seq谱高度相关（例如H3K27me3的Pearson相关系数 r=0.97）。

  2. 乳腺癌PDX模型中染色质异质性的揭示：研究将scChIP-seq应用于对化疗药物卡培他滨敏感（HBCx-95）和获得性耐药（HBCx-95-CapaR）的三阴性乳腺癌患者来源异种移植（PDX）模型。在基质细胞中，H3K27me3图谱揭示了三种不同的染色质状态群体（Chrom_c1, Chrom_c2, Chrom_c3），它们与特定的转录组特征（如成纤维细胞、免疫细胞特征）相匹配。在肿瘤细胞中，敏感和耐药细胞的H3K27me3图谱存在显著差异。重要的是，共识聚类分析发现，在未经治疗的敏感肿瘤（HBCx-95）中，有3%（13/484）的细胞与耐药细胞（HBCx-95-CapaR）共享相同的染色质特征（Chrom_c2）。这些“耐药样”细胞和真正的耐药细胞，相比敏感细胞（Chrom_c1），在许多基因位点失去了H3K27me3标记。




  3. 染色质特征与耐药性的关联：差异分析发现，在耐药/耐药样细胞（Chrom_c2）中特异性丢失H3K27me3的位点，富集了已知促进化疗耐药的基因，例如IGF2BP3。此外，还涉及上皮-间质转化（EMT）相关区域，如COL4A2和HOXD基因簇。在另一个对他莫昔芬敏感（HBCx-22）和耐药（HBCx-22-TamR）的luminal型乳腺癌PDX模型中，同样观察到16%（41/255）的敏感肿瘤细胞具有与耐药细胞相同的H3K27me3特征（Chrom_c2）。这些细胞中H3K27me3丢失的位点包含与耐药相关的基因，如EGFR。平行进行的scRNA-seq分析在敏感肿瘤中也发现了一个具有耐药细胞特征转录组（如基底样特征、EMT特征）的细胞亚群。

结论与意义：本研究开发的高通量scChIP-seq技术，首次在单细胞水平系统描绘了乳腺癌中染色质修饰的异质性图谱。研究发现，在未经治疗的敏感肿瘤中，已经存在一小部分具有与耐药细胞相同H3K27me3染色质特征的细胞亚群。这些细胞在关键基因位点（如IGF2BP3, EGFR）失去了抑制性标记H3K27me3，可能导致这些促耐药基因处于“预激活”或易激活状态，从而在药物选择压力下更容易产生耐药性。这表明染色质状态的异质性可能是肿瘤内在的、非遗传的耐药性预适应基础。该研究不仅为理解肿瘤进化提供了新的表观遗传维度，其技术平台也为在发育、分化等其它复杂生物系统中研究染色质异质性与动态变化开辟了道路。

参考文献：High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer

下载地址：Grosselin, K., Durand, A., Marsolier, J. et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nat Genet51, 1060–1066 (2019). https://doi.org/10.1038/s41588-019-0424-9

英文标题： Histone H3 lysine 36 methylation affects temperature induced alternative splicing and flowering in plants

中文标题： 组蛋白H3第36位赖氨酸甲基化影响温度诱导的可变剪接和植物开花

研究背景：全球变暖严重影响植物的开花时间和繁殖成功率。前体信使RNA (pre-mRNA)的可变剪接是植物响应环境温度控制的重要机制，但其调控机制尚不清楚。在拟南芥中，温度升高通过改变关键调控基因的剪接来促进植物形态变化以及从营养生长到生殖生长的转变。本研究旨在探究特定的组蛋白修饰是否影响环境温度诱导的可变剪接和开花时间。

主要发现：

  1. 温度变化诱导广泛的差异剪接事件：将拟南芥植株从16°C转移至25°C后，通过RNA测序（RNA-seq）分析，在1天、3天和5天的时间点共鉴定出683个温度诱导的差异剪接（DiS）事件，涉及511个不同的基因。这些事件在温度变化后一天内就已发生，并在此后保持稳定。这些基因包括已知的温度敏感剪接调控基因，如开花时间调控因子FLOWERING LOCUS M (FLM)和MADS AFFECTING FLOWERING 2 (MAF2)，以及剪接调控因子RS40等。

  2. 差异剪接基因富含H3K36me3修饰：对16°C和转移至25°C一天后的植株进行H3K36me3染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析，发现约96%的DiS基因在基因体内存在H3K36me3富集区域。这些基因包括FLM、MAF2、PRR3、PRR7、RS40等关键调控因子。与16°C相比，25°C下DiS基因转录起始位点（TSS）附近的H3K36me3水平更高，且修饰区域更宽。

  3. H3K36me3参与调控温度诱导的差异剪接：在H3K36me3甲基转移酶突变体sdg8-2和sdg26-1中，温度诱导的差异剪接事件发生改变。与野生型相比，许多在野生型中受温度影响的剪接事件在突变体中不再显著，例如FLM、MAF3、SCL33和PRR7等基因的剪接。H3K36me3依赖的剪接事件倾向于发生在靠近H3K36me3修饰区域的位置。在16°C恒温条件下，突变体与野生型之间的剪接差异很小，表明H3K36me3特异性参与高温诱导的剪接调控。


  4. H3K36me3相关基因突变影响高温诱导的开花：开花时间表型分析显示，在野生型中，温度从16°C升高到25°C会显著加速开花（抽薹天数减少）。然而，在H3K36me3甲基转移酶突变体sdg8-2和sdg26-1中，高温对开花的促进作用减弱或消失（抽薹天数比值接近1）。H3K36me3去甲基化酶突变体jmj30-1对温度诱导的开花更敏感，而过表达JMJ30则降低了对温度的响应。H3K36me3阅读蛋白突变体mrg1-1 mrg2-3也对温度诱导的开花响应减弱。

  5. H3K36me3调控剪接的可能机制：研究提出了H3K36me3调控剪接的潜在机制，可能涉及适配体复合物模型和动力学模型。在适配体复合物模型中，H3K36me3修饰的组蛋白被MRG1/2等适配蛋白结合，这些适配蛋白进而与PTB等剪接调控因子相互作用，将剪接机器招募到染色质附近。

结论：该研究揭示了组蛋白修饰H3K36me3在植物温度响应中的关键作用。温度升高导致许多关键调控基因（包括开花时间基因）发生快速且稳定的差异剪接。这些差异剪接基因高度富集H3K36me3修饰，且该修饰的水平与分布受温度影响。遗传学证据表明，H3K36me3的写入酶（SDG8/26）、擦除酶（JMJ30）和阅读蛋白（MRG1/2）共同调控温度诱导的差异剪接，并最终影响温度控制的开花时间。这为理解植物如何通过表观遗传机制整合环境温度信号以调控发育可塑性提供了新视角，并为培育更能适应气候变化的作物开辟了新前景。

参考文献：Pajoro A, Severing E, Angenent GC, Immink RGH. Histone H3 lysine 36 methylation affects temperature-induced alternative splicing and flowering in plants. Genome Biol. 2017 Jun 1;18(1):102. doi: 10.1186/s13059-017-1235-x. PMID: 28566089; PMCID: PMC5452352.

下载链接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC5452352/pdf/13059_2017_Article_1235.pdf




Q1：Input和IP样本之间的关系是什么？

答：Input和IP属于两个样本，在前期检测、建库、测序环节中都是平行进行的，但是分析中需要将两个样本的测序数据进行整合分析，得出最终的Peak结果，并进行后续分析。


Q2.Input是什么？有什么作用？

答：DNA片段化后，在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照（不进行免疫沉淀过程）。Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样本DNA一起经过逆转交联、DNA纯化以及其他方法检测。通过后续数据分析，我们可以通过Input对照排除背景噪音（非特异性结合所造成的假阳性Peaks），验证染色质断裂的效果和整个实验中IP效果，所以Input对照是IP-seq实验必不可少的步骤。


Q3:ChiP-seq需要几个平行重复？

答：一般建议3个平行生物学重复，在实验探索阶段可以先不做平行生物学重复。


Q4：ChiP的抗体怎么选择？

答：ChiP需要选择标签带有ChIP Validated / ChIP Grade 级别的抗体，不同靶标抗体选择要点：组蛋白及修饰（H3K4me3、H3K27ac、H3K27me3、H3K9me3 等）优先选择经过 ChIP-seq 验证的单克隆抗体，这类抗体背景信号低，测序峰型清晰规整。切勿选用仅适用于蛋白免疫印迹实验的普通组蛋白抗体，无法满足 ChIP 实验要求。转录因子（p53、Oct4、NF-κB 等）推荐使用 ChIP 验证级别的多克隆抗体。转录因子与染色质结合能力偏弱，且甲醛交联处理容易破坏抗原表位，多克隆抗体适用性更强、实验稳定性更好。转录因子相关 ChIP 实验整体信噪比偏低，实验中必须设置 Input 对照与 IgG 同型对照。表观修饰酶、共激活因子、共抑制复合物，优先挑选 ChIP 级别的多克隆抗体；若暂无对应产品，可尝试使用 IP 验证级别抗体。