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单细胞全基因组测序服务方案
单细胞全基因组DNA测序是一项很有挑战的工作，传统方法存在扩增片段对基因组的覆盖均一度低的问题，或者存在操作复杂、扩增产物得率低的问题。
我们采用全新的原代模板定向扩增（PTA，primary template-directed amplification）技术克服上述的瓶颈，为客户提供高覆盖均一度、高检测灵敏度、高检测准确性的单细胞全基因组DNA测序服务。
工作原理
PTA的工作原理图
用Phi29聚合酶进行扩增，Phi29酶是高保真的聚合酶
用抗核酸外切酶活性的终止子（化学修饰的核苷酸）实现准线性扩增
扩增产物中绝大多数扩增子直接来源于原始模板，进一步提高了扩增产物的保真度
扩增产物无法再次被复制，因此扩增过程中产生的有复制错误的扩增子不会被继续扩增
可扩增线粒体基因
与传统的MDA方法的比较
PTA与MDA扩增原理的比较图
在MDA方法中，部分容易被phi29酶扩增的序列会被优先进行指数级扩增，而其它序列没有被很好地扩增，这会造成扩增产物的均一度严重下降。而在PTA方法中，扩增产物无法被再次复制，这减少了指数扩增效应，同时也提高了扩增产物对基因组覆盖的均一性。。
因为MDA的指数扩增方式，会让扩增中引入的复制错误被指数级地放大，造成后续生物信息分析中，难以判断哪些突变是样品原有的突变，哪些突变是MDA复制过程中引入的错误，进而降低对基因突变判断的准确性。而PTA方法抑制了子代扩增片段的进一步扩增，因此复制错误不会被进一步放大，这大大提高了后续生物信息学分析时判读SNV的准确性。
实验效果
1、扩增产物的收率
从单个细胞、5个细胞和抽提好的微量DNA进行扩增的产物收率图
低起始量DNA的条件下，PTA全基因组扩增的产率和重现性表现：
可以从单细胞样本开始，
也可以从低至4pg的DNA开始
得到1µg以上的扩增DNA产物
2、扩增产物测序结果对基因组的覆盖均一程度
超高覆盖均一性：MDA vs. PTA
单细胞PTA的测序结果中，对基因组的覆盖均一性远高于传统的MDA方法。
Bulk测序，均一性好，但无法揭示细胞间的异质性
单细胞MDA测序，均一性不好，重现性低
单细胞PTA测序，均一性远好于MDA，重现性好，可高清地展现细胞间的异质性
3、对基因组覆盖率的比较
几种单细胞基因组扩增并测序的结果，与bulk测序结果的比较
在相同测序深度下，PTA对基因组的覆盖率最接近Bulk测序的水平，并且远超其它几种单细胞基因组扩增的方法
4、对SNV检出率的比较
几种单细胞基因组扩增并测序后，检出SNV的效果，与bulk测序结果的比较
在相同的测序深度下，PTA方法检测到SNV的比例最接近于bulk测序的水平，并且远超其它几种单细胞基因组扩增的方法
应用
1.生殖健康与遗传：胚胎突变携带者研究，染色体非整倍体和微缺失微重复研究
2.肿瘤：胚系及体系肿瘤突变研究，CTC循环肿瘤细胞研究，ctDNA循环肿瘤DNA研究
3.司法：微起始量DNA样本的基因分型
与参考基因组比对率、测序深度、覆盖度分析
样本比对率，指比对到参考基因组上的数据量除以有效测序数据量，反映样本测序数据与参考基因组的相似性。测序深度，指比对到参考基因组的碱基总数除以基因组大小；覆盖度，指被测到的该物种基因组碱基总数占该物种基因组长度的百分比；测序深度和覆盖度能够直接反应测序数据的均一性及与参考序列的同源性。
基因功能富集分析
对注释、筛选得到的候选基因进行GO，Pathway，miRNA，Disease，Proteome，Phenotype等功能富集。富集分析中采用P-value的多重检验 校正值Q-value来控制FDR（False Discovery Rate），此外，也可以采取更严格的Bonferroni多重校正法（Bonferroni multiple correction method）。 缺省富集显著性阈值为控制FDR的Q-value<0.05。
候选基因集蛋白互作网络分析
对候选基因集进行蛋白互作网络分析，寻找相互作用的共调控基因。和代谢通路类似的，不同患者的突变基因可能不同，但是存在相互作用的基因突 变导致的表型可能是一致的。寻找存在相互作用的突变基因，能够帮助定位真正和疾病相关的致病基因。
克隆结构分析
肿瘤异质性主要是肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出基因方面的改变，从而使肿瘤细胞的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感 性、预后等各方面产生差异。对肿瘤组织进行克隆结构分析正是基于肿瘤异质性，通过信息分析手段，将肿瘤组织内遗传突变信息相似的肿瘤细胞进行聚类。