生物科技模板

单细胞全基因组测序服务方案

单细胞全基因组DNA测序是一项很有挑战的工作，传统方法存在扩增片段对基因组的覆盖均一度低的问题，或者存在操作复杂、扩增产物得率低的问题。

我们采用全新的原代模板定向扩增（PTA，primary template-directed amplification）技术克服上述的瓶颈，为客户提供高覆盖均一度、高检测灵敏度、高检测准确性的单细胞全基因组DNA测序服务。

工作原理

PTA的工作原理图

1. 用Phi29聚合酶进行扩增，Phi29酶是高保真的聚合酶

2. 用抗核酸外切酶活性的终止子（化学修饰的核苷酸）实现准线性扩增

3. 扩增产物中绝大多数扩增子直接来源于原始模板，进一步提高了扩增产物的保真度

4. 扩增产物无法再次被复制，因此扩增过程中产生的有复制错误的扩增子不会被继续扩增

5. 可扩增线粒体基因

与传统的MDA方法的比较

PTA与MDA扩增原理的比较图

在MDA方法中，部分容易被phi29酶扩增的序列会被优先进行指数级扩增，而其它序列没有被很好地扩增，这会造成扩增产物的均一度严重下降。而在PTA方法中，扩增产物无法被再次复制，这减少了指数扩增效应，同时也提高了扩增产物对基因组覆盖的均一性。。

因为MDA的指数扩增方式，会让扩增中引入的复制错误被指数级地放大，造成后续生物信息分析中，难以判断哪些突变是样品原有的突变，哪些突变是MDA复制过程中引入的错误，进而降低对基因突变判断的准确性。而PTA方法抑制了子代扩增片段的进一步扩增，因此复制错误不会被进一步放大，这大大提高了后续生物信息学分析时判读SNV的准确性。

实验效果

1、扩增产物的收率

从单个细胞、5个细胞和抽提好的微量DNA进行扩增的产物收率图

低起始量DNA的条件下，PTA全基因组扩增的产率和重现性表现：

1. 可以从单细胞样本开始，

2. 也可以从低至4pg的DNA开始

3.    得到1µg以上的扩增DNA产物

2、扩增产物测序结果对基因组的覆盖均一程度

超高覆盖均一性：MDA vs. PTA

单细胞PTA的测序结果中，对基因组的覆盖均一性远高于传统的MDA方法。

Bulk测序，均一性好，但无法揭示细胞间的异质性

单细胞MDA测序，均一性不好，重现性低

单细胞PTA测序，均一性远好于MDA，重现性好，可高清地展现细胞间的异质性

3、对基因组覆盖率的比较

几种单细胞基因组扩增并测序的结果，与bulk测序结果的比较

在相同测序深度下，PTA对基因组的覆盖率最接近Bulk测序的水平，并且远超其它几种单细胞基因组扩增的方法

4、对SNV检出率的比较

几种单细胞基因组扩增并测序后，检出SNV的效果，与bulk测序结果的比较

在相同的测序深度下，PTA方法检测到SNV的比例最接近于bulk测序的水平，并且远超其它几种单细胞基因组扩增的方法

应用

1.生殖健康与遗传：胚胎突变携带者研究，染色体非整倍体和微缺失微重复研究

2.肿瘤：胚系及体系肿瘤突变研究，CTC循环肿瘤细胞研究，ctDNA循环肿瘤DNA研究

3.司法：微起始量DNA样本的基因分型