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在功能基因组学和表观遗传学研究中，发掘转录因子结合位点（Transcription FactorBinding Sites）一直是研究热点。传统的 ChIP-seq（染色质免疫共沉淀测序）方法，在抗体质量很好的情况下能够有效检测到转录因子结合位点。然而，要获得 ChIP-seq 级别的高质量抗体难度很大，所以高质量抗体的缺乏限制了 ChIP-seq 的大规模扩展。2016 年，Cell 期刊发表了使用 DNA 亲和纯化测序技术（DNA Affinity Purification Sequencing, DAP-seq）在基因组水平上，快速精准鉴定转录因子结合位点的论文（O'Malley et al., 2016）。2017 年，Nature Protocol 发表了DAP-seq 的实验方法（Bartlett et al., 2017）。DAP-seq 技术的出现，使转录因子结合位点的研究不再局限于任何物种，不再受抗体质量的限制，进一步拓展和加深了生命科学和医学领域的研究广度和深度。DAP-seq 是通过体外蛋白表达技术，表达出带有标签的转录因子，然后和基因组 DNA文库在体外进行结合，进一步分离出所有与转录因子结合的 DNA，再使用高通量测序技术，找到转录因子的结合位点。
DAP-seq 和 ChIP-seq 的技术特点
DAP-seq 实验技术流程
DAP-seq 样品要求
对两个技术重复样本，以及对照 Input 的 DAP-seq 文库进行 NGS 测序。对数据进行质控和比对后进行 call Peak，注释及相关基因富集、motif 分析。
Peaks 合并的韦恩图
Peaks 在 TSS 附近的分布
Peaks 在染色体上的分布
Peaks 在基因组功能区的分布
Peak 相关基因的富集分析
富集区间 Motif 分析
Motor neuron and pancreas homeobox 1 (MNX1) suppresses Triple Negative Breast Cancer (TNBC) cell phagocytosis by macrophage through CD24 signaling
中文标题： 运动神经元和胰腺同源盒转录因子 1 (MNX1) 通过 CD24 信号通路抑制巨噬细胞对三阴性乳腺癌 (TNBC) 细胞的吞噬作用
研究背景：三阴性乳腺癌 (TNBC) 是一种侵袭性强、治疗选择有限的乳腺癌亚型。运动神经元和胰腺同源盒转录因子 1 (MNX1) 在多种癌症进展中被涉及，但其在 TNBC 免疫逃逸中的作用尚不清楚。CD24 是一种在多种癌症中高表达的糖蛋白，最近被鉴定为肿瘤细胞表面的抗吞噬信号分子，通过与巨噬细胞上的 Siglec-10 结合，介导肿瘤免疫逃逸。值得注意的是，MNX1 作为转录因子，其调控靶点以及与 CD24 表达的关系在 TNBC 中尚未阐明。
主要发现：
MNX1 在 TNBC 中高表达并与不良预后相关：通过分析 TCGA 数据集，发现 MNX1 在 TNBC 组织中的表达显著高于癌旁正常组织 (ANT) 。Kaplan-Meier 生存分析显示，MNX1 高表达的 TNBC 患者生存率更差。免疫组化染色证实，MNX1 和 CD24 在 TNBC 组织中的蛋白水平均高于 ANT。
MNX1 直接结合并转录激活 CD24：通过DNA 亲和纯化测序 (DAP-seq) 分析确定了 MNX1 的主要 DNA 结合基序为“TAATTA” 。对 CD24 启动子区域 ( -1999 到 +1) 的分析显示存在多个 TAATTA 基序，提示 CD24 可能是 MNX1 的直接靶基因 。双荧光素酶报告基因实验证实，MNX1 能与野生型 CD24 启动子结合并显著激活其转录活性，而突变启动子中的 TAATTA 结合位点则会削弱这种激活作用 。在 MDA-MB-468 细胞中敲低 MNX1，可导致 CD24 在 mRNA 和蛋白水平的表达下降；而在 MDA-MB-231 细胞中过表达 MNX1，则可上调 CD24 的表达。这些结果证明 MNX1 是 CD24 的转录激活因子。
MNX1抑制巨噬细胞对TNBC细胞的吞噬作用：基因集富集分析 (GSEA)显示 MNX1 表达谱与巨噬细胞激活的调控相关 。将 TNBC 细胞与由 THP-1 细胞诱导分化的 M2 型巨噬细胞共培养 。流式细胞术分析显示，敲低 MNX1 的 MDA-MB-468 细胞被巨噬细胞吞噬的比例显著增加；而过表达 MNX1 的 MDA-MB-231 细胞被吞噬的比例则降低。
MNX1敲低在体内增强巨噬细胞浸润并抑制肿瘤生长：建立了人源化巨噬细胞免疫重建小鼠异种移植模型。流式细胞术证实模型成功重建了人源免疫细胞和巨噬细胞 。在荷瘤小鼠中，敲低 MNX1 导致肿瘤组织中 CD24 表达下降 ，同时伴随巨噬细胞 (CD11b+) 浸润增加 。与对照组相比，MNX1 敲低组的肿瘤生长受到显著抑制 。
MNX1与CD24在多癌种中的相关性：利用 TIMER 2.0 工具进行的泛癌分析显示，MNX1 与 CD24 在多个癌症类型中存在表达相关性。
结论：
Populus euphratica WRKY1 binds the promoter of H⁺-ATPase gene to enhance gene expression and salt tolerance
中文标题： 胡杨WRKY1结合H⁺-ATPase基因启动子以增强基因表达和耐盐性
研究背景：土壤盐渍化是全球性的严重生态与环境问题。胡杨 (Populus euphratica) 作为木本植物耐盐性研究的模式物种，其在高盐环境下维持离子稳态的能力主要与质膜H⁺-ATPase有关。该质子泵通过促进Na⁺/H⁺逆向转运来实现Na⁺外排。虽然H⁺-ATPase的活性常受到转录后调控，但盐胁迫下其基因的转录调控，尤其是在树木中，尚未被充分研究。WRKY转录因子是植物响应逆境的一类重要调控蛋白。此前研究发现，盐胁迫能诱导胡杨中PeWRKY1的表达，并且该因子能增强转基因植物的Na⁺外排和K⁺保留能力，而这一过程被认为依赖于质膜H⁺-ATPase的驱动。值得注意的是，PeHA1（胡杨质膜H⁺-ATPase基因）的启动子区域含有WRKY蛋白的特异性结合顺式元件W-box，这暗示WRKY1可能直接调控PeHA1的表达。
主要发现：
盐胁迫诱导PeHA1与PeWRKY1的表达：高浓度NaCl (200 mM) 处理能显著上调胡杨根和叶中PeHA1基因的表达。同时，盐胁迫也快速诱导了PeWRKY1在根和叶中的转录，其表达趋势与PeHA1相似。
PeWRKY1直接结合并激活PeHA1启动子：DNA亲和纯化测序 (DAP-seq) 显示，PeHA1是PeWRKY1蛋白的直接靶基因，其结合的核心基序为“TTGAC”。酵母单杂交、电泳迁移率变动分析 (EMSA)和荧光素酶报告基因实验 (LRA)均证实，PeWRKY1能特异性结合PeHA1启动子中的W-box元件并激活其转录。相反，当利用病毒诱导的基因沉默 (VIGS) 技术降低胡杨中PeWRKY1表达时，盐胁迫下的PeHA1表达也显著下降。
PeWRKY1通过增强H⁺-ATPase活性提升耐盐性：过表达PeWRKY1的转基因烟草株系 (L-9, L-12) 表现出更强的耐盐性，其盐胁迫下的叶片鲜重降低更少，丙二醛 (MDA) 积累和Na⁺含量也更低。机理上，转基因植株根尖的H⁺外排泵活性在盐胁迫下更强，根细胞膜电位更负。体外实验进一步证明，转基因植株质膜囊泡的H⁺-ATPase水解活性与质子转运活性均显著高于野生型。
分子机制延伸：PeWRKY1上调烟草同源基因NtHA4：在转基因烟草中，盐胁迫诱导的H⁺-ATPase基因NtHA4（其启动子含有W-box）表达被PeWRKY1显著增强，而启动子不含W-box的NtHA2则未出现此效应。这表明PeWRKY1通过保守的W-box机制跨物种调控H⁺-ATPase基因。
PeHA1启动子的组织特异性与盐响应性：将PeHA1启动子与GUS报告基因融合并转化烟草，发现该启动子在根、叶、茎中均有活性，且盐胁迫能显著增强其在所有组织，尤其是根中的活性。
结论：
该研究阐明了胡杨响应盐胁迫的一条关键转录调控通路：盐胁迫诱导转录因子PeWRKY1表达，其编码蛋白直接结合到质膜H⁺-ATPase基因PeHA1的启动子W-box元件上，从而激活PeHA1的转录。增强的H⁺-ATPase活性促进了质子泵出，为Na⁺外排提供了驱动力，最终帮助植物维持Na⁺稳态和耐盐性。这一发现为通过分子育种手段改良树木乃至作物的耐盐性提供了重要的基因靶点和理论依据。
参考文献：Yao, J., Shen, Z., Zhang, Y. et al. Populus euphratica WRKY1 binds the promoter of H⁺-ATPase gene to enhance gene expression and salt tolerance. J Exp Bot (2020).
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